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文章名稱：Lung metastasis and recurrence is mitigated by CAR macrophages, in-situ-generated from mRNA delivered by small extracellular vesicles

中文名稱：由小型細胞外囊泡遞送mRNA在體內(nèi)生成的CAR巨噬細胞可顯著抑制肺癌轉(zhuǎn)移與復發(fā)

雜志名：nature communications

期刊影響因子：15.7

第一作者：Yuchen Xiao, Tianchuan Zhu

通訊作者：Xi Huang

發(fā)表日期：2025.8.4

https://doi.org/10.1038/s41467-025-62506-2

研究內(nèi)容

概述：

本文設計了一種吸入式的納米遞送系統(tǒng)：

把編碼CAR（靶向間皮素）的 mRNA 放到小型細胞外囊泡（sEV）里，并在囊泡表面裝上能識別 M2 型巨噬細胞表面受體 CD206 的單鏈抗體片段。

這樣吸入后，這些帶有識別標記的囊泡會在肺里累積，并被M2 巨噬細胞攝取。囊泡里的mRNA 在巨噬細胞內(nèi)被翻譯為 CAR 蛋白，從而把這些巨噬細胞改造為有抗腫瘤吞噬能力的 CAR-M。

與體外培養(yǎng)再回輸?shù)募毎煼ㄏ啾?，這種原位（in-situ）生成 CAR-M 的方式，避免了復雜的細胞制造過程，并減少了全身給藥導致的肝臟富集問題。

動物實驗表明：吸入給藥能減少肺轉(zhuǎn)移腫瘤量、延長生存，并促進免疫記憶，能有效抑制腫瘤復發(fā)。

研究背景

腫瘤的轉(zhuǎn)移與復發(fā)，是導致癌癥死亡的主要原因。肺是常見的轉(zhuǎn)移位點，傳統(tǒng)的CAR-M（嵌合抗原受體改造的巨噬細胞）在治療實體瘤上前景不錯，但面臨制造復雜，以及靜脈注射后主要在肝臟累積以至肺可達性差等問題。本文提出：如果能在腫瘤所在器官（肺）原位把巨噬細胞改造成CAR-M，就能避開這些問題并提升治療效果。

實驗方案

1.sEV 設計與制備

構建表達mesothelin（MSLN）特異性 CAR 的 mRNA（CAR^{mRNA}）；并將其裝載進工程化的小型細胞外囊泡（sEV）。

在sEV 表面整合 anti-CD206 scFv（記作 aCD206）以靶向 M2 型巨噬細胞，并通過額外修飾（如 L7Ae/C-box 模塊、Cx43 修改等）提高 mRNA 裝載與遞送效率。對 sEV 的形貌（TEM）、蛋白標志（CD63、TSG101 等）和 mRNA 含量做了表征。

2.體外驗證（巨噬細胞培養(yǎng)與功能驗證）

用骨髓來源巨噬細胞（BMDMs）極化成 M2 型后，檢測 sEV 的攝取（internalization）、CAR mRNA 的翻譯（用 EGFP 替換 CAR 作示蹤）、以及 CAR 蛋白的表達（流式/免疫熒光/Western blot）。

評估CAR-M 的功能性：對靶細胞（B16 小鼠黑色素瘤細胞構建的 MSLN 表達系）進行吞噬實驗、細胞毒性實驗、細胞因子釋放檢測等。

3.免疫細胞互作與轉(zhuǎn)錄/信號通路檢測

用Transwell 共培養(yǎng)（sEV 處理后的 BMDM 在下室，T 細胞或 DC 在上室）評估 CAR-M 對 T 細胞增殖、DC 成熟等的旁分泌/抗原呈遞影響（用 CFSE 標記 T 細胞，流式分析）。同時用 qPCR / heatmap / western blot 檢測吞噬后上調(diào)的信號通路（如 AKT、NF-κB、ERK）。

4.體內(nèi)給藥與抗腫瘤療效

在小鼠肺轉(zhuǎn)移模型中比較吸入（inhalation）與靜脈注射兩種給藥方式的組織分布（Fluc 或 DiR 示蹤）、巨噬細胞中 CAR 表達、腫瘤生長（生物發(fā)光、病理切片）、腫瘤微環(huán)境（流式細胞譜系分析、細胞因子測定）和長期復發(fā)/生存率。

CAR^mRNA@aCD206 sEVs制備過程示意圖

CAR^mRNA@aCD206在肺轉(zhuǎn)移癌中的靶向遞送及抗腫瘤機制。

實驗結果

1.sEV 能有效加載并攜帶 CAR mRNA，工程化sEV 在形貌、表面標志與 mRNA 含量上得到良好驗證。

2.體外：aCD206-修飾的 sEV 更易被 M2 BMDM 攝取，能夠在細胞內(nèi)產(chǎn)生 CAR（EGFP 示例證明翻譯），并使巨噬細胞表現(xiàn)出增強的抗原特異性吞噬、釋放更多促炎細胞因子（IFN-γ、TNF-α），在體外對 MSLN 陽性腫瘤細胞的吞噬與細胞毒性更強。

3.免疫互作：在Transwell 共培養(yǎng)中，CAR-M 能通過旁分泌或抗原遞呈促進 T 細胞增殖并誘導 DC 成熟（Transwell 里上室的 CFSE-標記 T 細胞與 DC 的指標顯示出明顯提升），提示 CAR-M 有助于激活適應性免疫并可能引起“表位擴展”。

4.體內(nèi)：吸入給藥相比靜脈注射能使sEV 在肺中更高富集并更有效地在肺巨噬細胞中誘導 CAR 表達（流式與組織免疫熒光證明）。吸入CAR^mRNA@aCD206 sEVs能顯著抑制肺轉(zhuǎn)移瘤負荷（生物發(fā)光、肉眼/HE切片），延長動物生存，并產(chǎn)生長期免疫記憶，同時肝臟富集問題明顯緩解。

討論

通過將CAR^mRNA 遞送到腫瘤組織內(nèi)的巨噬細胞，可在不進行復雜體外細胞制造的情況下產(chǎn)生功能性CAR-M，從而優(yōu)化生物分布、增強局部抗腫瘤免疫，并減少系統(tǒng)性副作用。

該技術在肺轉(zhuǎn)移模型上效果顯著，并顯示可誘導長期免疫記憶以預防復發(fā)。作者認為該sEV 平臺具有推廣到其他靶抗原和組織的潛力，但要注意提升 mRNA 載入效率、特異性靶向以及臨床轉(zhuǎn)化中的劑量和安全性評估。

論文中用到的NEST產(chǎn)品

細胞小室

使用到的NEST產(chǎn)品：細胞小室

1.T 細胞增殖實驗

研究人員把CFSE 標記的 T 細胞放在 Transwell 上室，把巨噬細胞（BMDM/CAR-M）放在下室，檢測是否能通過分泌因子促進 T 細胞增殖。結果顯示：CAR-M 顯著增強了 T 細胞的增殖能力。

2.樹突狀細胞成熟實驗

將未成熟DC放在上室，巨噬細胞放在下室，共培養(yǎng)后檢測 DC 的成熟標志物。結果顯示：CAR-M 能有效促進 DC 成熟，增強免疫激活作用。

經(jīng)過與B16-MSLN 細胞共孵育預處理后的 M2 型 BMDM，在 Transwell 實驗中對 T 細胞增殖的影響

G 經(jīng)過與 B16-MSLN 細胞共孵育預處理后的 M2 型 BMDM，在 Transwell 實驗中對樹突狀細胞（DC）成熟（CD11c?CD80?CD86?）的影響

NEST細胞小室的優(yōu)勢

細胞小室在細胞實驗中很常用，如：共培養(yǎng)實驗、趨化實驗、細胞遷移實驗、細胞侵襲以及藥物轉(zhuǎn)運。其中，通透性支持物可以有效改善極性細胞的培養(yǎng)，因為這些支持物允許細胞從其基底面和頂面分泌和吸收分子，從而以更為自然的方式進行代謝，最大程度地模擬體內(nèi)環(huán)境以培養(yǎng)某些特殊的細胞系。